نمو و تكاثر البكتيريا و ادق تعريف لاسمدة الحيوية

من المعلوم أن كلمة نمو تطلق على الزيادة فى الكتلة الخلوية Cell mass لخلية و احدة أو لمجموعة من الخلايا كالمستعمرة Colony ، بينما كلمة Reproduction(التكاثر) تدل على الزيادة فى عدد الخلايا Cell numberنتيجة الانقسام، الا أنه فى الكائنات الدقيقة وحيدة الخلية كالبكتريا فان كلمة النمو تساوى كلمة التكاثر فى المعنى حيث يقصد بها زيادة فى أعداد الميكروبات.
هذا النمو البكتيرى مثل غيره يتأثر بالظروف المحيطة به من:-
1- عوامل طبيعية: الحرارة- الرطوبة- الضوء...
2- عوامل كيماوية: كتوافر الغذاء القابل للتمثيل – و وجود مواد سامة...
3- عوامل بيولوجية: مثل التنافس بين الكائنات الحية- التطفل- الافتراس- المعيشة التعاونية.
هذه العوامل تؤثر على درجة نمو و تأقلم الكائنات الدقيقة لذا يجب معرفتها و دراستها بكل دقة حتى نتمكن من التحكم فى معدل نمو هذه الميكروبات اما بالزيادة أو النقصان حسب ما نحتاجه منها.
التكاثر اللاجنسى للبكتريا:
تتكاثر البكتريا الحقيقية لاجنسيا بطريقة الانقسام الثنائى البسيط Binary fission or Simple transverse fission حيث يتم:
1- زيادة فى المحتويات البروتوبلازمية و زيادة فى طول الخلية0
2- انقسام المحتويات النووية ( الكروموسومات)0
3- تكون غشاء سيتوبلازمى عرضى Transverse membrane بظهور بروزان جانبيان فى منطقتين متقابلتين من السطح الداخلى للغشاء السيتوبلازمى، و ينموان معا فى اتجاه مركز الخلية على طول المحور العرضى ثم يلتحم هذان البروزان.
4- ينشق الغشاء السيتوبلازمى الى غشائين منفصلين نتيجة لتكوين جدار خلوى بينهما و يتكون هذا الجدار أيضا من الخارج الى الداخل.
5- يعقب ذلك انشقاق الجدار الخلوى العرضى المتكون بدوره طوليا الى قسمين.
6- بذلك تصبح الخلية خليتين، هاتان الخليتان الجديدتان اما تنفصلا عن بعضهما مباشرة أو يحدث الانفصال بعد مدة، أو تظلا ملتصقتين ليكونا سلسلة من الخلايا أو التجمعات حسب النوع.
و الخلية الجديدة الناتجة تحمل الصفات الاصلية للخلية الام، كما أن النظام الوراثى هو الذى يتحكم فى عملية الانقسام.
ونلاحظ أن البكتريا غير الحقيقية تتكاثر بطرق أخرى بالاضافة الى طريقة الانقسام السابقة مثل التبرعم و تجزء الخيوط و تكون الكونيديا.
التكاثر الجنسى: Sexual Reproduction
التكاثر اللاجنسى بطر يقة الانقسام الثنائى البسيط هو الطريقة الشائعة لتكاثر البكتريا الحقيقية، و لقد أمكن حديثا اثبات حدوث تكاثر جنسى فى البكتريا و ذلك عن طريق مشاهدة انتقال صفات الآباء الى الأجيال المتعاقبة، و قد أمكن وراثيا اثبات حدوث من الالتحام أو التزاوج Fusionبين الخلايا حيث تعتبر أحد الخلايا الملتحمة موجبة و الأخرى سالبةو على ذلك فانه يمكن عن طريق التكاثر الجنسى انشاء هجن جديدة لهاخواص ذات أهمية.
منحنى النمو للبكتريا: Bacterial growth curve
من المعلوم ان معدل التكاثر لأغلب أنواع البكتريا سريع، فاذا لقحت خلية واحدة من E.coliفى بيئة غذائية ملائمة فانها تنقسم لتصبح خليتين بعد 20 دقيقة و تستمر الخلايا الناتجة فى الأنقسام المتكرر، و اذا استمر هذا المعدل فى التكاثر ثابتا، فان الخلية الواحدة ستعطى مليار ميكروب بعد 10 ساعات و لكن هذا المعدل لايستمر هكذا الى مالا نهاية، نتيجة لاستهلاك مكونات البيئة الغذائية و تراكم نواتج تمثيل الميكروبات و موت العذيد منها.. و قد لوحظ أن معدل الموت يزداد بتقدم عمر المزرعة.
و تتفاوت أنواع البكتريا فى سرعة تكاثرها فعمر الجيل Generation timeو هى الفترة التى تمر بين انقسامين متتاليين يختلف من ميكروب لاخر فى كثير من الأنواع حيث تتراوح مابين 20-30 دقيقة، أما الأنواع البطيئة فقد يصل عمر الجيل الى عدة ساعات.
و نلاحظ أن معدل تكاثر Growth rateالميكروب فى البيئة المغذية لا يكون ثابتا حيث يحدث فى هذه المراحل المختلفة تغيرات فى الشكل و الحجم و العدد، و يمكن معرفة ذلك بعد البكتريا بالمزرعة على فترات، و بتسجيل هذه القرءات على منحنى يمثل معدل الزيادة فى أعداد البكتريا مع الوقت تظهر لدينا الأطوار المختلفة من سرعة نمو الميكروب و يسمى هذا المنحنى الناتج منحنى النمو Growth curve و يمثله هذا الرسم المبين:
وهذا المنحنى ينقسم الى أربع أطوار:
1- الطور اللاجى( طور الركود) Lag phase
2- طور النمو الوغاريتمى (طور التكاثر السريع) Logarithmic phase
3- الطور الثابت Stationary phase
4- طور الهبوط Decline phase



الطور اللاجى(الركود) Lag phase:
عقب تلقيح البيئة الغذائية بالميكروبات فانها تتوقف عن الانقسام لفترة ثم تبدأ فى الانقسام و لكن ببطء شديد. ثم يسرع معدل الانقسام حتى يصل الى درجة يثبت عليها.و رغم أن الخلايا لاتنقسم فى هذا الطور أو تنقسم ببطء شديد الا أن عملية التخليق البرؤوتوبلازمى بداخلها تكون مستمرة فتزداد البكتريا فى الحجم حتى تصل الى ضعف أو 3 أضعاف حجمها الأصلى ويزداد تنفسها و تمثيلها الغذائى ، و يظهر البروتوبلازم متجانسا، و مدة هذا الطور تطول أو تقصر تبعا لعوامل كثيرة منها:
- كمية اللقاح البادىء. - عمر المزرعة. - الوسط المناسب.
فتقصر مدة هذا الطور بزيادة كمية اللقاح المضاف و بصغر عمرها و نشاطها و تشابه الوسط الجديد بالسابق الذى كانت نامية فيه.
و تطول المدة اذا كانت كمية اللقاح قليلة أو من خلايا مسنة أو متجرثمة أو أن البيئة الجديدة مختلفة عن القديمة. و هذه العوامل هامة جدا فى الصناعات الغذائية و التخميرية.
2- الطور اللوغاريتمى Logarithmic phase:
سمى بهذا الاسم لأن معدل التكاثر فيه يكون لوغاريتمى، بمعنى لو رسم لوغاريتم العدد مع الزمن يكون خطا مستقيما و هو طور التكاثر السريع للميكروب. و يكون عمر الجيل ثابتا و يحدده العوامل الوراثية و الظروف البيئية السائدة.
فعلى سبيل المثال يكون عمر الجيل 20 دقيقة لبكتريا E. coli تحت الظروف المناسبة بينما تزيد الى عدة ساعات لجنس Mycobacterium و تصل الى حوالى 18 ساعة فى جنس Azospirillumوفى هذا الطور تظهر الخلايا صغيرة الحجم، ويبقى البروتوبلازم متجانسا و قرب نهاية هذا الطور تظهر الحبيبات فى البروتوبلازم.
و طول مدة هذا الطور تتوقف على الظروف التى تؤثر على البكتريا فيصل لأقصاه عند توفرالغذاء و فى صورة ملائمة و عند درجة الحرارة المثلى المناسبة و عدم حدوث تراكم كبير فى نواتج التمثيل الغذائى، و يمكن اطالة هذا الطور باضافة مواد غذائية جديدة الى المزرعة و معادلة المواد السامة الناتجة عن التمثيل الغذائى.
تقدير عدد الأجيال و طول عمر الجيل:
وفى هذا الطور يمكن تقدير عدد الأجيال (ن) و طول عمر الجيل (ج) عمليا بتلقيح البيئة بعدد معلوم من الخلايا ثم التحضين على درجة حرارة مناسبة ثم يقدر عدد البكتريا، و بمعرفة العدد فى البداية(أ) و العدد فى النهاية(ب) و المدة ما بين التقديرين (ت) يمكن معرفة عمر الجيل و عدد الأجيال.
و الزيادة فى عدد الخلايا يمكن أن يعبر عنه بالطريقة التالية:
عدد الخلايا: 1 – 2 – 4 – 8 – 16 – 32 - .............. (ب)
عدد الأجيال: 0 - 1 – 2- 3 – 4 – 5 – ................ (ن)
فيكون العدد الكلى للبكتريا فى النهاية (ب) لعدد (ن) من الأجيال = 1 x 2ن بفرض أننا بدأنا بخلية واحدة.
و اذا بدأنا بعدد (أ) من الخلايا فان:
العدد النهائى (ب) = أ x2ن
و بأخذ لوغاريتم الأعداد لو ب = لوأ + ن لو2
اذن:
ن = لو ب - لوأ = لو ب - لوأ
لو2 0.3010
طول الجيل (ج) = الوقت الذى يمر بين تقديرين بالدقيقة(ت)
عدد الأجيال (ن)
ج = ت
ن
و بذلك يمكن معرفة عدد الأجيال (ن) و طول عمر الجيل (ج).
3- الطور الثابت: Stationary phase
عند نهاية الطور الوغاريتمى ينخفض معدل التكاثر حتى يصبح عدد الخلايا البكتيرية فى المزرعة ثابت تقريبا، وبذلك تكون الخلايا الجديدة مساوية لعدد الخلايا الميتة، أى أن الخلايا تستمر فى نشاطها و لكن تكاثرها يكون بطيئا.
و فى هذا الطور تظهر الخلايا متجانسةالحجم و الشكل و تبدأ المواد المخزنة فى الظهوربوضوح فى الخلايا، كما تظهر الجراثيم فى الأنواع المتجرثمة، وحدوث هذا الطور الثابت و عدم استمرار الطور اللوغاريتمى ينتج من نفاذ المواد المغذية و تراكم نواتج التمثيل الغذائى فى البيئة بدرجة تضر بالميكروبات و بزيادة أثر هذه العوامل الضارة يمكن أن ينتهى هذا الطور و يبدأ ما يسمى بطور الهبوط و بالتالى فانه يمكن اطالة هذا الطور باضافة مواد مغذية جديدة او بمعادلة المواد التالفة أو جفاف المزرعة أو بالتخزين على درجة حرارة منخفضة لأن خفض درجة الحرارة يقلل سرعة التمثيل الغذائى، و كلما زادت أعداد الخلايا وكانت الظروف غير ملائمة كلما قصرت فترة الطور الثابت.
و يستفاد من خاصية تخزين الميكروبات فى الطور الثابت على درجة حرارة منخفضة عمليا لفائدة منتجى و موزعى مزارع البكتريا العقدية و مزارع البكتريا المستعملة كبادءات فى المنتجات اللبنية، و فى الخميرة المضغوطة و غيرها، اذ يجب الاحتفاظ بهذه الميكروبات فى الطور الثابت لأطول مدة ممكنة لحين استعمالها و فى بداية هذا الطور تجرى الاختبارات البكتريولوجية على الميكروب بالفحص الميكروسكوبى مثلا.
4- طور الهبوط Decline phase:
بعد الطور الثابت يزيد معدل موت الخلايا عن معدل تكاثرها، و يحدث تناقص مستمر فى عدد الخلايا، و يزداد معدل التناقص تدريجيا ويصبح معدل الموت لوغاريتميا و هو عكس معدل النمو اللوغاريتمى المميز للطور اللوغاريتمى وبعد طور الهبوط تموت كل الخلايا فى فترة تتراوح من عدة أيام الى عدة سنوات حسب نوع البكتريا و بموت الخلايا فانها تتحلل ذاتيا نتيجة للنشاط الانزيمى الموجودة بها عقب موتها و فى هذا الطور تظهر الخلايا بأشكال غريبة غير منتظمة غير متجانسة فى الحجم أو الشكل، و يرى التحبب فى البروتوبلازم واضحا، و تنفرد الجراثيم من الخلايا و تتحلل باقى الخلايا و اذا ما لقحت بيئة مناسبة للنمو بهذه الخلايا غير المتجرثمة، فانها تعيد دورة حياة الميكروب من جديد، و تظهر الصفات الثابتة للميكروب فى أوائل الطور الثابت.

************

طرق تقدير النمو البكتيرى Estimating methods of bacterial growth
يقدر النمو البكتيرى كميا بعدة طرق، و سنشير الى الفكرة الأساسية و مميزات بعض الطرق المستعملة.
1- العد المباشر بالميكروسكوب Direct microscopic count:
تعتبر هذه الطريقة من الطرق المباشرة، و التى تعطى العدد الكلى للبكتريا مباشرة بما فى ذلك الحى و الميت، و تمتاز هذه الطريقة بأنها من الطرق السريعة و لكن يعاب عليها أنها لا يمكن التمييز بين البكتريا الحية و الميتة فى الشريحة كما أنه يصعب التمييز بين مكونات البيئة و الميكروبات فى بعض الأحيان و من الصعب استخدامها لعد البكتريا النامية فى بيئات صلبة لتكتل البكتريا و صعوبة فرزها، كما أنه عند استعمال بيئات تحتوى على أعداد كثيفة أو خفيفة من الميكروبات فانه يلزم عمل تخفيفات أو تركيزات مناسبة هذا بالاضافة الى أن الطريقة اذا استخدمت بدقة و باستمرار تكون مجهدة للنظر.
و من الطرق الميكروسكوبية المباشرة:
أ- طريقة شريحة بريد Bread smear .
ب- غرفة العد Counting chamber .
2- العد بطريقى الأطباق Plate count :
و هذه الطريقة من الطرق غير المباشرة لاجراء العد البكتيرى و فيها يقدر عدد البكتريا الحى فقط، أى القادر على التكاثر، و لكن يعاب عليها أنها تحتاج لوقت طويل و الى أوات و أجهزة كما انها تعطى عدد أقل من العدد الحقيقى اذ أن البيئة المستخدمة و ظروف التحضين و النمو لا تناسب كل أنواع البكتريا الموجودة بالعينة الجارى دراستها، هذا بالاضافة الى أن المستعمرات المتكونة من ميكروب واحد أو من سلسلة أو من كتلة من الميكروبات، و تستعمل هذه الطريقة بكثرة لتقدير عدد البكتريا فى المياه و اللبن و الأغذية و التربة و غيرها.

3- طريقة التخفيف التقريبيةDilution frequency method:
و تعرف هذه الطريقة بطريق العدد الأكثر احتمالا Most Probable Number (MPN) و هى من الطرق غير المباشرة لاجراء عدد البكتريا الحية فقط فى مزرعة بطريقة تقريبية و تستعمل هذه الطريقة فى فحص عينات الماء و المجارى للكشف عن التلوث فى الأراضى. و عيوب هذه الطريقة مثل العيوب التى ذكرت فى الطريقة السابقة، بالاضافة الى أن هذه الطريقة تحتاج الى عدد كبير من الأنابيب، و تعطى نتائج تقريبية.
4- تقدير الوزن الجاف Dry weight :
و هى من الطرق المباشرة لتقدير الكتلة الخلوية، و تتميز هذه الطريقة بسرعة اجرائها و بساطتها، ولكن يعاب أنها تقدر الخلايا الحية و الميتة، و فى هذه الطريقة يؤخذ جزء من المزرعة المراد تقدير النمو فيها، ثم تفصل هذه الخلايا بترسيبها بالطرد المركزى، تجفف الخلايا على درجة 105 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ثم تبرد و توزن و يقدر الوزن الجاف للخلايا.
5- تقدير محتويات الخلايا من النيتروجينNitrogen Content:
و هى مثل الطريقة السابقة فى كونها مباشرة كما يعاب عليها أيضا أنها تقدر الخلايا الحية و الميتة، علاوة على أنها طريقة معقدة و لا يمكن اجراؤها الا فى المزارع الكثيفة المغسولة جيدا، الخالية من أى مصدر نيتروجيى غير الخلايا البكتيرية.
و لتقدير النمو البكيترى بهذه الطريق، تجمع الخلايا أولا بالقوى الطاردة المركزية و تغسل عدة مرات لتخليصها من البيئة الغذائية، ثم يقدر فيها كمية النيتروجين كيماويا بطريقة الميكروكلداهل. و من الطبيعى فان كمية النيتروجين المقدرة ستكون متكافئة مع عدد و حجم الخلايا حيث أن النيتروجين من أهم مكونات البروتين الذى يكون غالبية محتويات الخلية البكتيرية، و فى أغلب أنواع البكتريا فان نسبة النيتروجين فى البروتين البكتيرى تكون حوالى 14% من الوزن الجاف للبروتوبلازم و ان كان ذلك يتغير ذلك النوع و الظروف البيئية.
6- استخدام القياسات البصرية Optical method:
و هذه من الطرق غير المباشرة لتقدير النمو، و تعتبر من الطرق الكثيرة الاستعمال لسرعتها و دقتها الا أنها يعاب عليها أنها تقدر الخلايا الحية و الميتة معا و لا يمكن استعمالعا فى حالة المواد الملونة بعمق كبير أو التى تحتوى على مواد أخلرى عالقة غير الخلايا البكتيرية.
و من الطرق المستخدمة طريقة الألوان Colorimetric و طريقة الاسبكتروفوتوميتر Spectrophotometric و طرق تقدير درجة التعكير Turbidimetric و الأساس فى هذه الطرق، أنه عندما يمر شعاع ضوئى فى معلق بكتيرى فان جزء منه يمتص بواسطة المعلق، و بذلك فان كمية الأشعة النافذة من المعلق Transmitted تتناسب عكسيا مع كثافة هذا المعلق، اى كلما زاد تعكيرالبيئة نتيجة زيادة النمو كلما قلت قراءة الجهاز، بمعنى أن القراءة تكون متناسبة عكسيا مع عدد الخلايا، و يقاس الضوء النافذ باستعمال وحدة ضوئية حساسةPhotometric cell فى جهاز مناسب مثل جهازTurbidimeter, Colorimeter, Spectrophotometer مع استعمال مرشحات ضوئية مناسبة بحيث يستعمل منها ما يمكن للمعلق البكتيرى أن يمتص أكبر كمية من الضوء النافذ، و تقدر درجة التعكير على موجة طولها 420 نانوميتر للمعلقات غير الملونة، و للمعلقات ذات اللون الأصفر أو الذى يميل الى البنى تستعمل موجة طولها 600 ملليميكرون و هكذا تقيم النتائج المتحصل عليها بطرق العد الأخرى المعروفة. و لسرعة اسخلاص النتائج تعمل منحنيات قياسية Standard curves تربط بين القراءات المأخوذة و البيانات الأخرى المطلوبة مثل عدد الخلايا، الوزن الجاف، المحتوى النيتروجينى...الخ.